Quenching della fluorescenza ed equazione di Stern-Volmer

Abstract: in questo articolo descriviamo alcune misure di quenching della fluorescenza in alcune sostanze. Il fenomeno del quenching (smorzamento) si verifica quando alcune molecole assorbono l’energia dei fluorofori. Questo interessante fenomeno può essere utilizzato in misure quantitative per la determinazione della concentrazione del quencher ed anche, tramite il modello di Stern-Volmer, per lo studio del decadimento temporale della fluorescenza.

Introduzione

Lo smorzamento (in inglese quenching) è il fenomeno attraverso il quale viene smorzata la fluorescenza; esso è dovuto a molecole che assorbono energia (ad esempio atomi di metalli oppure ossigeno). Se lo smorzamento della fluorescenza è dovuto a molecole adiacenti alla molecola emittente, facenti parte dello stesso materiale, si parla di autosmorzamento.

Lo smorzamento può essere di tipo statico o collisionale. Lo smorzamento statico consiste nella formazione di un complesso non fluorescente tra il fluoroforo, ovvero la molecola che fluoresce e lo smorzatore, ovvero la molecola responsabile del fenomeno in questione, che si trova vicino al fluoroforo. Nello smorzamento di tipo collisionale, gli smorzatori invece si trovano sparsi in soluzione, e scontrandosi col fluoroforo ne assorbono energia.
Gli smorzatori sono molecole con elevato grado di libertà vibrazionale, come l’acqua, che assorbe quasi tutta l’energia del fluoroforo, oppure ioni paramagnetici o ancora ioni di atomi pesanti come iodio, bromo, ecc. Lo smorzamento di tipo collisionale è favorito dalla temperatura, la quale, evidentemente, incrementa l’energia cinetica. Questo sfavorisce la fluorescenza e la fosforescenza, è bene quindi far avvenire la fluorescenza e la fosforescenza a temperature basse, in modo da evitare che i possibili smorzatori in soluzione possano influenzarle. La cinetica del processo è descritto dall’equazione di Stern-Volmer.
Dallo studio del quenching della fluorescenza, utilizzando il modello di Stern-Volmer, è anche possibile ricavare indicazioni quantitative sul tempo di decadimento della fluorescenza stessa.

Setup Sperimentale

Il setup sperimentale consiste nel sistema per le misure della fluorescenza, descritto nel precedente post spettroscopia di fluorescenza. Si tratta di una cuvette holder, una sorgente di eccitazione a led ed uno spettrometro a fibra ottica (noi abbiamo utilizzato un B&W Tek ricondizionato). L’apparato viene mostrato in figura 1.

Fig.1 – Setup per la misurazione dello spettro di fluorescenza

La sorgente di eccitazione della fluorescenza è un LED di alta qualità pilotato da un driver che garantisce stabilità della corrente di erogazione, in modo da avere una intensità luminosa di eccitazione costante durante le misurazioni. Abbiamo utilizzato due LED, uno che emette nel vicino ultravioletto, per le misure sul chinino, ed uno che emette nella banda del blu, per le misure sulla fluoresceina. Il LED UV viene mostrato in figura 2, mentre nelle figure 3 e 4 vengono riportati gli spettri di emissione dei due LED.

Fig.2 – il LED di eccitazione

Fig.3 – Spettro di emissione del LED UV

Fig.4 – Spettro di emissione del LED blu

Misure sul chinino quenched con NaCl

Fig.5 – Spettri di fluorescenza del chinino a varie concentrazioni del quencher NaCl

Fig.6 – Retta di regressione della equazione di Stern – Volmer per la fluorescenza del chinino

Misure sulla fluoresceina quenched con KI

Fig.7 – Spettri di fluorescenza della fluoresceina a varie concentrazioni del quencher KI

Fig.8 – Retta di regressione della equazione di Stern – Volmer per la fluorescenza della fluoresceina

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