Spettroscopia di Fluorescenza

Abstract: in questo post descriviamo l’applicazione dello spettrometro SMA Thunder Optics e del software Spectragryph nelle misure sulla fluorescenza. Applicheremo la tecnica della spettroscopia di fluorescenza allo studio di alcuni composti chimici di particolare rilievo ed interesse.

Introduzione sulla Fluorescenza

La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di riemettere (a lunghezza d’onda maggiore e quindi a energia minore) le radiazioni elettromagnetiche ricevute, in particolare di assorbire radiazioni nell’ultravioletto e riemetterla nel visibile. Il meccanismo della fluorescenza è il seguente: una radiazione incidente eccita gli atomi della sostanza fluorescente, promuovendo un elettrone a un livello energetico (orbitale) meno legato, più energetico e quindi più “esterno”. Entro poche decine di nanosecondi, l’elettrone eccitato torna al livello precedente in due o più fasi, passando cioè per uno o più stati eccitati a energia intermedia. Tutti i decadimenti tranne uno sono, di solito, non radiativi, mentre l’ultimo emette luce a lunghezza d’onda maggiore rispetto alla radiazione incidente: questa emissione è detta fluorescenza (Fig. 1).

Fig. 1 – Assorbimento della radiazione di eccitazione ed emissione della radiazione di fluorescenza

Possiamo quindi aspettarci che lo spettro di emissione si sovrapponga parzialmente allo spettro di assorbimento in corrispondenza alla lunghezza d’onda corrispondente alla transizione di fluorescenza, mentre il resto dello spettro di emissione sarà ad energia inferiore o, in altri termini, a lunghezza d’onda maggiore. In pratica, le transizioni interessate negli spettri di assorbimento ed emissione non coincidono mai esattamente, la differenza rappresenta una piccola perdita di energia che avviene per interazione della molecola assorbente con le circostanti molecole di solvente. Questa differenza viene chiamata stokes shift.

In un post precedente: Spettrometro Thunder Optics & Spectragryph, abbiamo descritto lo spettrometro SMA della Thunder Optics (nel seguito indicato come spettrometro TO) e lo abbiamo utilizzato per acquisire gli spettri di alcune sorgenti luminose. Proseguiamo ora l’attività di sperimentazione “esplorando” con questo strumento, con i suoi accessori e con il software Spectragryph, la tecnica della spettroscopia di fluorescenza. In particolare utilizzeremo questa tecnica per analizzare la fluorescenza di una serie di composti chimici di particolare interesse.

La Misura della Fluorescenza

Il software Spectragyph facilita la misura della fluorescenza. La modalità di misurazione selezionata definisce il tipo di asse y dello spettro live misurato: intensity, transmittance, reflectance, absorbance (Fig. 2). Per la fluorescenza sceglieremo la modalità intensity.

Fig. 2 – Selezione Measurement Mode

A seconda della modalità scelta possono essere necessari uno o più spettri ausiliari. Gli spettri ausiliari sono il Dark spectrum, il Reference spectrum ed il Blank spectrum. Ciascuno di questi può essere impostato, rimosso e visualizzato in qualsiasi momento. Non appena vengono assegnati, vengono memorizzati e tenuti pronti per un successivo utilizzo. Per aggiornarli è sufficiente impostarli nuovamente con uno spettro live appena misurato. Il Dark spectrum (Fig. 3) ed il Blank spectrum (Fig. 5) sono opzionali, quindi il loro utilizzo deve essere attivato facendo clic sul rispettivo pulsante. Il Reference spectrum (Fig. 4) è sempre obbligatorio eccetto che per la modalità intensity, quindi, quando necessario, viene utilizzato automaticamente dal sistema.

Fig. 3 – Assegnazione Dark spectrum

Fig. 4 – Assegnazione Reference spectrum

Fig. 5 – Assegnazione Blank spectrum

Modalità di misura degli spettri ausiliari:

• Dark spectrum: sorgente luminosa spenta, otturatore chiuso, nessuna luce raggiunge il rilevatore, modalità di misurazione: intensity
• Reference spectrum: sorgente luminosa accesa, piena luce (livello 100%) che raggiunge il rivelatore, modalità di misura: intensity
• Blank spectrum: con campione “vuoto” (ad esempio solvente puro o tampone nel contenitore del campione), con la modalità finale di misurazione selezionata

Ogni spettro dovrebbe essere misurato nuovamente dopo aver modificato il tempo di esposizione, inoltre lo spettro di riferimento va aggiornato dopo ogni variazione di intensità della luce di eccitazione. Per migliorare l’accuratezza della misura è sempre consigliato acquisire anche il dark spectrum ed attivarne l’utilizzo. Lo stesso vale per il blank spectrum, in genere per ogni situazione va valutato quali spettri ausiliari vanno acquisiti ed utilizzati. In generale la formula per il calcolo della intensità utilizzata dal software è la seguente:

Intensità: Live = Raw – Dark – Blank

Materiali e Metodi

In genere, nella rilevazione della fluorescenza, la sorgente luminosa di eccitazione ed il detector per la misura dell’emissione sono collocati ad angolo retto uno rispetto all’altro (Fig. 6). Per specifiche misure quantitative si fa spesso uso di filtri ottici che hanno lo scopo di discriminare tra la sorgente di eccitazione e l’emissione fluorescente. Il detector è un rilevatore di luce, ad esempio un fotodiodo oppure, quando i livelli di intensità sono molto bassi, un fotomoltiplicatore.

Fig. 6 – Schema di principio per la misura della fluorescenza confrontato con il metodo di misura della assorbanza

La radiazione di fluorescenza ha un suo spettro caratteristico la cui intensità dipende a sua volta dalla intensità e dalla lunghezza d’onda della radiazione di eccitazione. Nelle misure fatte in questo lavoro abbiamo utilizzato una sorgente di eccitazione a lunghezza d’onda fissa ed abbiamo utilizzato lo spettrometro TO per la registrazione dello spettro della emissione. Come sorgente di eccitazione abbiamo adottato un laser DPSS (diode pumped solid state) con emissione a circa 406 nm ed uno con emissione a 445 nm.
Le soluzioni da esaminare sono state inserite nelle classiche cuvette da spettrofotometria (12x12x45 mm). Per le soluzioni alcoliche abbiamo utilizzato una cuvette di quarzo, per le soluzioni acquose abbiamo adottato cuvette plastiche “usa e getta”. Durante la misura le provette sono collocate nel cuvette holder. La Fig. 7 mostra il setup sperimentale.

Fig. 7 – Setup sperimentale

Come si vede nella immagine di dettaglio di Fig. 8, il laser di eccitazione e la fibra per la raccolta della luce di emissione sono collocati ad angolo retto l’uno rispetto all’altro.

Fig. 8 – Setup sperimentale – cuvette holder e DPSS Laser

L’intensità della radiazione di fluorescenza può variare moltissimo a seconda della lunghezza d’onda di eccitazione, della sua intensità, della concentrazione della soluzione (maggiori concentrazioni danno maggiore fluorescenza ma anche maggiore autoassorbimento) e ovviamente dipende dalla sostanza in esame. Nella Fig. 9 ad esempio, si vede la forte fluorescenza di colore rosso acceso prodotta dalla clorofilla.

Fig. 9 – La fluorescenza nel cuvette holder

Spettroscopia di Fluorescenza della Clorofilla

La clorofilla è un pigmento di colore verde presente nei grani dei cloroplasti delle cellule vegetali o negli organismi procarioti che realizzano la fotosintesi clorofilliana. La struttura della molecola è caratterizzata dalla presenza di un eterociclo porfirinico, al centro del quale è coordinato uno ione Mg. Per la nostra misura di fluorescenza (Fig. 10) abbiamo utilizzato degli spinaci che sono stati sminuzzati a lasciati macerare in etanolo. Il nostro campione è quindi costituito dal pigmento solubilizzato in etanolo. Il picco di emissione si ha a 674 nm (rosso) e si estende nella regione dell’infrarosso a circa 800 nm. La misura è stata fatta sia con il laser a 406 nm  che con il laser a 445 nm: come si vede dal diagramma lo spettro dell’emissione è praticamente il medesimo a parte qualche piccola variazione nella intensità.

Fig. 10 – Spettro di fluorescenza della clorofilla

Spettroscopia di Fluorescenza del Ru(bpy)₃

Il sale di rutenio noto come Ru(bpy)₃ è un solido cristallino rosso, solubile in acqua e in solventi organici polari. Il suo catione [Ru(bpy)₃]²⁺ è uno dei complessi chimici più studiati nei laboratori fotochimici. Il motivo di tale interesse risiede in una combinazione unica di stabilità chimica, proprietà redox, luminescenza e reattività allo stato eccitato. I processi che coinvolgono questo composto spesso vengono indicati come esempio di fotosintesi artificiale. In soluzione il composto assume colorazione giallo-arancione-rossa in funzione della concentrazione molare. Lo spettro di fluorescenza è mostrato nel grafico di Fig. 11. Come sorgente di eccitazione abbiamo utilizzato il laser blu con emissione a 445 nm, corrispondente al picco di massimo assorbimento. La fluorescenza è intensa e si colloca sulla banda rosso-arancione con il massimo attorno ai 610 nm.

Fig. 11 – Spettro di fluorescenza della molecola Ru(bpy)₃

Spettroscopia di Fluorescenza dell’Olio di Oliva

Anche l’olio di oliva extravergine, grazie all’elevato contenuto di clorofilla, mostra una intensa fluorescenza rossa quando viene eccitato da una sorgente luminosa nella banda UV oppure nella banda del blu. Il grafico in Fig. 12 mostra lo spettro che si ottiene irradiando l’olio con il laser da 445 nm.

Fig. 12 – Spettro di fluorescenza dell’olio di oliva

Spettroscopia di Fluorescenza della Fluoresceina

La fluoresceina è il “prototipo” dei coloranti fluorescenti. A temperatura ambiente si presenta come un solido rosso-bruno inodore, molto solubile in acqua, che emette una intensa fluorescenza molto caratteristica nella gamma 520-530 nm, di colore giallo-verde (Fig. 13), soprattutto quando viene eccitata nella gamma del blu a 465-490 nm.

Fig. 13 – Spettro di fluorescenza della fluoresceina

Spettroscopia di Fluorescenza della Cumarina

La cumarina  è un composto aromatico. A temperatura ambiente si presenta in forma di cristalli incolori, dall’odore caratteristico. Isolata per la prima volta da Dipteryx odorata, il cui nome popolare era per l’appunto coumarin, la cumarina è presente in più di 27 famiglie di vegetali, ed è responsabile dell’odore dolce dell’erba appena tagliata. La cumarina è usata anche come un mezzo di guadagno in alcuni laser a colorante e come sensibilizzante in tecnologie fotovoltaiche. Assorbe a lunghezze d’onda inferiore a 400 nm e presenta forte fluorescenza a 460 nm (Fig. 14).

Fig. 14 – Spettro di fluorescenza della cumarina

Spettroscopia di Fluorescenza del Cristallo di Rubino

il cristallo di rubino mostra una spettacolare fluorescenza rossa quando viene eccitato da luce viola o blu-verde, con una doppia emissione a 692,80 e 694,30 nm, che appare come una linea singola. Nell’immagine di copertina e nell’immagine di Fig. 15 mostriamo il nostro cristallo di rubino illuminato dal laser violetto a 406 nm. Il cristallo emette una forte fluorescenza rossa (Fig. 16). Questa emissione è interessante per la sua intensità, la sua linea di emissione molto stretta (responsabile della lucentezza e del colore del cristallo) e per la lunga durata della fluorescenza.

Fig. 15 – Fluorescenza del rubino

Fig. 16 – Spettro di fluorescenza del rubino

Spettroscopia di Fluorescenza dei Quantum Dots

Un punto quantico (dall’inglese quantum dot) è una nanostruttura formata da un’inclusione di un materiale semiconduttore, con una certa banda proibita e con dimensioni tipiche comparabili alla lunghezza d’onda di De Broglie, all’interno di un altro semiconduttore con banda proibita più grande. Tale struttura genera un pozzo tridimensionale di potenziale che confina i portatori di carica (elettroni e lacune) in una piccola regione di spazio in cui i livelli energetici divengono discreti. Quest’ultima proprietà ha portato all’associazione tra punti quantici ed atomi generando lo pseudonimo di “atomi artificiali”.

In questa nostra prova vogliamo misurare la fluorescenza prodotta da una soluzione colloidale di quantum dots, eccitata da un laser DPSS a 406 nm. In particolare intendiamo mostrare che la lunghezza d’onda della emissione è legata alla dimensione del Quantum Dot: maggiore è la dimensione e maggiore sarà la lunghezza d’onda della radiazione fluorescente. Per questo esperimento sono state utilizzate soluzioni colloidali di QuantumDots di tipo CdTe (Cadmio – Tellurio) prodotte dalla PlasmaChem (Fig. 17) aventi le seguenti caratteristiche dichiarate:

CdTe hydrophilic quantum dots	Declared Emission max (nm)	CdTe radius (nm)	Average molar weight (Da)
PL-QDN-520	520	2,04	16’000
PL-QDN-570	570	3,12	59’000
PL-QDN-600	600	3,39	76’000
PL-QDN-640	640	3,66	96’000
PL-QDN-680	680	4,22	146’000

Fig. 17 – Soluzioni colloidali di quantum dots

Gli spettri di fluorescenza ottenuti con lo spettrometro TO ed il software Spectragryph sono mostrati nella Fig. 18. Si vede come al crescere del raggio del QD l’emissione della fluorescenza si sposta verso lunghezze d’onda maggiori, passando dai 540 nm ed arrivando fino ai 680 nm.

Fig. 18 – Spettri di fluorescenza dei QD

Spettroscopia della Fosforescenza del’Europio

La fosforescenza è il fenomeno di emissione radiativa da parte di alcuni materiali in seguito all’assorbimento di energia attraverso raggi ultravioletti (molto energetici) e la successiva riemissione sotto forma di luce visibile (a energia inferiore). I materiali fosforescenti continuano ad emettere luce anche fino a molte ore dopo la fine dell’illuminamento esterno. Quando tutta l’energia accumulata si esaurisce, il materiale non emette più luce. L’emissione radiativa deriva dal decadimento degli elettroni a livelli quantici di minore energia. Si distingue dalla fluorescenza perché in quest’ultima l’effetto è immediato e si interrompe appena viene interrotta la fonte di energia, mentre nella fosforescenza l’effetto continua anche dopo. Il principio, semplificato, è lo stesso: una fonte di energia, in genere composta da luce visibile o radiazione ultravioletta, eccita gli atomi, facendo saltare alcuni elettroni su un’orbita più esterna. Quando questi tornano sull’orbita interna emettono luce.

L’alluminato di stronzio attivato dall’europio è un nuovo materiale che presenta fosforescenza con alta luminosità e lunga persistenza. Le lunghezze d’onda di eccitazione per l’alluminato di stronzio variano tra i 200 e i 450 nm. La lunghezza d’onda di emissione verde è di 520 nm, per la versione verde-azzurra è di 505 nm, mentre per la versione blu è di 490 nm. Il diagramma seguente (Fig. 19) mostra lo spettro della fosforescenza eccitata dal laser DPSS a 406 nm.

Fig. 19 – Spettro di fosforescenza del composto a base di europio

La fosforescenza decade lentamente e questo ci permette, registrando gli spettri ad intervalli regolari, di valutare l’andamento temporale della intensità della emissione. Il diagramma di Fig. 20 mostra gli spettri registrati, ad intervalli di 5 secondi l’uno dall’altro, dopo lo spegnimento della sorgente di eccitazione. Si vede che l’intensità diminuisce, prima velocemente e poi più lentamente. Con maggiore dettaglio, nel grafico di Fig. 21, abbiamo riportato l’intensità della emissione alla lunghezza d’onda di 520 nm rispetto al tempo. La curva di decadimento viene in genere approssimata con una legge di potenza.

Fig. 20 – Spettri della fosforescenza registrati ad intervalli regolari di 5 sec.

Fig. 21 – Andamento temporale della intensità della fosforescenza

Conclusioni

Il nostro apparato composto da spettrometro SMA Thunder Optics e cuvette holder si è dimostrato più che adeguato per l’analisi qualitativa e quantitativa della fluorescenza delle soluzioni che abbiamo esaminato. Se l’intensità della fluorescenza è elevata la misura può essere fatta con la fibra ottica, se l’intensità è bassa oppure se non è disponibile una fibra di diametro sufficiente si può operare anche accoppiando direttamente spettrometro e cuvette holder. I risultati ottenuti sono comunque ottimi, a dimostrazione della bontà del setup sperimentale.

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