Spettroscopia di Assorbimento

Abstract: in questo post descriviamo l’applicazione dello spettrometro SMA Thunder Optics e del software Spectragryph nelle misure di assorbanza. Applicheremo la tecnica della spettroscopia di assorbimento allo studio di alcune soluzione liquide di composti colorati.

Introduzione

In un post precedente: Spettrometro Thunder Optics & Spectragryph, abbiamo descritto lo spettrometro SMA della Thunder Optics (nel seguito indicato come spettrometro TO) e lo abbiamo utilizzato per acquisire gli spettri di alcune sorgenti luminose. Proseguiamo ora l’attività di sperimentazione “esplorando” con questo strumento, con i suoi accessori e con il software spectragryph, la tecnica della spettroscopia di assorbimento. In particolare utilizzeremo questa tecnica per analizzare le caratteristiche ottiche di una serie di soluzioni liquide di composti colorati di particolare interesse.

La Misura dell’Assorbanza

L’assorbanza (in passato densità ottica, indicata con D) è l’intensità di radiazione elettromagnetica che viene assorbita da un corpo, in spettroscopia è definita come l’opposto del logaritmo della trasmittanza.

A = -log₁₀T = -log₁₀(Φ_t / Φ₀) = log₁₀(Φ₀) – log₁₀(Φ_t)

Dove Φ₀ e Φ_t sono rispettivamente il flusso luminoso incidente ed emergente dal campione in esame. L’assorbanza, per soluzioni aventi concentrazione sufficientemente bassa, è in relazione lineare con la concentrazione del campione secondo la legge di Lambert-Beer. Attraverso tale relazione, la misura di assorbanza è alla base della analisi chimica quantitativa fatta con tecnica spettrofotometrica.

Il software Spectragyph automatizza il calcolo della assorbanza. La modalità di misurazione selezionata definisce il tipo di asse y dello spettro live misurato: intensity, transmittance, reflectance, absorbance (Fig. 1). Sceglieremo la modalità absorbance.

Fig. 1 – Selezione Measurement Mode

A seconda della modalità scelta possono essere necessari uno o più spettri ausiliari. Gli spettri ausiliari sono il Dark spectrum, il Reference spectrum ed il Blank spectrum. Ciascuno di questi può essere impostato, rimosso e visualizzato in qualsiasi momento. Non appena registrati, vengono memorizzati e tenuti pronti per un successivo utilizzo. Per aggiornarli è sufficiente impostarli nuovamente con uno spettro live appena misurato. Il Dark spectrum (Fig. 2) ed il Blank spectrum (Fig. 4) sono opzionali, quindi il loro utilizzo deve essere attivato facendo clic sul rispettivo pulsante. Il Reference spectrum (Fig. 3) è sempre obbligatorio eccetto che per la modalità intensity, quando necessario, viene utilizzato automaticamente dal sistema.

Fig. 2 – Assegnazione Dark spectrum

Fig. 3 – Assegnazione Reference spectrum

Fig. 4 – Assegnazione Blank spectrum

Modalità di misura degli spettri ausiliari:

• Dark spectrum: sorgente luminosa spenta, otturatore chiuso, nessuna luce raggiunge il rilevatore, modalità di misurazione: intensity
• Reference spectrum: sorgente luminosa accesa, piena luce (livello 100%) che raggiunge il rivelatore, modalità di misura: intensity
• Blank spectrum: con campione “vuoto” (ad esempio solvente puro o tampone nel contenitore del campione), con la modalità finale di misurazione selezionata

Ogni spettro dovrebbe essere misurato nuovamente dopo aver modificato il tempo di esposizione, inoltre lo spettro di riferimento va aggiornato dopo ogni variazione di intensità della luce di eccitazione. La sorgente luminosa di riferimento dovrebbe avere uno spettro il più possibile piatto su tutta la gamma di lunghezze d’onda di interesse. Lampade di questo tipo sono ad esempio quelle alogene oppure le lampade allo xenon. Se una lampada siffatta non è disponibile si può utilizzare anche una sorgente luminosa diversa, basta che abbia una intensità costante nel tempo. Noi abbiamo utilizzato la sorgente ad incandescenza Mini Light Source (Sorgenti di luce) della Thunder Optics. 

Per migliorare l’accuratezza della misura è sempre consigliato acquisire anche il dark spectrum ed attivarne l’utilizzo. Lo stesso vale per il blank spectrum, in genere per ogni situazione va valutato quali spettri ausiliari vanno acquisiti ed utilizzati. In generale la formula utilizzata dal software per il calcolo della assorbanza è la seguente:

Assorbanza: Live = – log10 ( (Raw – Dark) / (Reference – Dark) ) – Blank

Materiali e Metodi

Per la misura dell’assorbanza delle soluzioni si può utilizzare lo spettrometro TO accoppiato direttamente  con il cuvette holder e con la sorgente di luce di riferimento (Fig. 5 a), oppure si può anche utilizzare il collegamente tramite fibra ottica e connettore SMA (Fig. 5 b). Per l’utilizzo della fibra è consigliato adottare fibre con core di almeno 200 μm in modo da raccogliere una quantità sufficiente di luce. Utilizzare una sorgente alogena o allo xenon, intrinsecamente più intense, permetterebbe l’utilizzo agevole anche di fibre più “sottili”, ad esempio da 100 μm.

Fig. 5 a – Setup con accoppiamento diretto (senza fibra) per le misure di assorbanza

Fig. 5 b – Setup con fibra per le misure di assorbanza

Le soluzioni da esaminare sono state inserite nelle classiche cuvette da spettrofotometria (12x12x45 mm). Per le soluzioni alcoliche abbiamo utilizzato una cuvette di quarzo, per le soluzioni acquose abbiamo adottato cuvette plastiche “usa e getta” (Fig. 6).

Fig. 6 – (a) Cuvette con clorofilla  (b) Cuvette con ftalocianina

Spettroscopia della Clorofilla

La clorofilla è un pigmento di colore verde presente nei grani dei cloroplasti delle cellule vegetali o negli organismi procarioti che realizzano la fotosintesi clorofilliana. La struttura della molecola è caratterizzata dalla presenza di un eterociclo porfirinico, al centro del quale è coordinato uno ione Mg. Si possono individuare due tipi principali di clorofilla:

• Clorofilla a, assorbe soprattutto la luce blu-violetta e rossa (picchi di assorbimento a 430 nm e 663 nm)
• Clorofilla b, assorbe soprattutto la luce blu ed arancione (picchi di assorbimento a 480 nm e 650 nm)

Per la nostra misura di assorbanza (Fig. 7) abbiamo utilizzato degli spinaci che sono stati sminuzzati a lasciati macerare in etanolo. Il nostro campione è quindi costituito dal pigmento solubilizzato in etanolo.

Fig. 7 – Spettro di assorbimento della clorofilla

Spettroscopia della Ftalocianina

La ftalocianina è un composto eterociclico la cui struttura chimica è simile a quella delle porfirine naturali. La ftalocianina, caratterizzata da un intenso colore verde-blu, è ampiamente utilizzata come colorante. La ftalocianina forma complessi coordinati con molto elementi della tavola periodica. Anche questi composti risultano intensamente colorati e trovano svariate applicazioni come coloranti e pigmenti. Lo spettro di assorbimento, riportato in Fig. 8, mostra forte assorbanza tra 550 nm e 750 nm.

Fig. 8 – Spettro di assorbimento della ftalocianina

Spettroscopia del Ru(bpy)₃

Il sale di rutenio noto come Ru(bpy)₃ è un solido cristallino rosso, solubile in acqua e in solventi organici polari. Il suo catione [Ru(bpy)₃]²⁺ è uno dei complessi chimici più studiati nei laboratori fotochimici. Il motivo di tale interesse risiede in una combinazione unica di stabilità chimica, proprietà redox, luminescenza e reattività allo stato eccitato. I processi che coinvolgono questo composto spesso vengono indicati come esempio di fotosintesi artificiale. In soluzione il composto assume colorazione giallo-arancione-rossa in funzione della concentrazione molare. La soluzione mostra un forte assorbimento nella banda che va da 400 nm a 550 nm (Fig. 9).

Fig. 9 – Spettro di assorbimento del Ru(bpy)3

Spettroscopia dell’Olio di Oliva

Lo spettro di assorbimento dell’olio di oliva extra vergine, acquisito dallo spettrometro e mostrato in Fig. 10, mostra notevole somiglianza con lo spettro della clorofilla, segno che questa sostanza è presente all’interno dell’olio di oliva. La banda di assorbimento dai 400 nm ai 500 nm è anche una caratteristica tipica della categoria dei carotenoidi.

Fig. 10 – Spettro di assorbimento dell’olio d’oliva

Spettroscopia della Fluoresceina

La fluoresceina è il “prototipo” dei coloranti fluorescenti. A temperatura ambiente si presenta come un solido rosso-bruno inodore, molto solubile in acqua, che emette una intensa fluorescenza nella gamma 520-530 nm (di colore giallo-verde, molto caratteristica) quando viene eccitata da raggi ultravioletti a 254 nm e nella gamma del blu 465-490 nm. Lo spettro di assorbimento mostrato (Fig. 11) evidenzia la forte assorbanza tra 450 e 500 nm.

Fig. 11 – Spettro di assorbimento della fluoresceina

Spettroscopia del Blu Bromotimolo e la Misura del pH

Il blu di bromotimolo è un composto organico utilizzato come indicatore di pH. Si presenta in soluzione concentrata di etanolo come un liquido di colore verde-blu. Nella sua forma normale (acida) è di colore giallo, mentre la sua base coniugata è blu; per questa differenza di colore tra le due forme il blu di bromotimolo è usato come indicatore di pH. Ha un intervallo di viraggio compreso tra pH 6,0 e pH 7,6.

La forma protonata, cioè con pH acido, di blu di bromotimolo ha il picco di assorbimento attorno a 450 nm, trasmette quindi luce gialla in soluzioni acide, mentre la forma deprotonata, cioè con pH basico, ha il picco di assorbimento attorno a 600 nm, trasmettendo così la luce blu in soluzioni basiche. Il viraggio del colore è evidente anche nello spettro di assorbimento acquisito dallo spettrometro e mostrato in Fig. 12.

Fig. 11 – Spettro di assorbimento della soluzione di Blu di bromotimolo in funzione del pH della soluzione

Conclusioni

Il nostro apparato composto da spettrometro SMA Thunder Optics e mini light source si è dimostrato più che adeguato per l’analisi qualitativa e quantitativa della assorbanza delle soluzioni che abbiamo esaminato. Analisi di questo tipo in genere fanno uso di sorgenti di luce alogene oppure allo xenon, le quali garantiscono una emissione intensa e con spettro “piatto” rispetto ad una lampada ad incandescenza. Lo spettrometro ed il software spectragryph hanno comunque compensato adeguatamente lo spettro non costante della sorgente di luce utilizzata, permettendo di ottenere ottimi risultati.

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