Misure di Fluorescenza con SiPM

Abstract: in questo articolo presentiamo il progetto di un fluorimetro basato su un fotomoltiplicatore SiPM. Gli impulsi di eccitazione sono prodotti da un LED pilotato da un “pulser” che genera impulsi di corrente molto brevi. Il segnale prodotto dal SiPM viene amplificato e acquisito mediante un multichannel analyzer. Lo spettro del segnale corrisponde all’intensità dell’impulso di fluorescenza, il quale, a sua volta, è proporzionale alla concentrazione del fluoroforo. L’elevata sensibilità del SiPM permette di ottenere misure precise anche in presenza di concentrazioni di fluoroforo molto basse.

Introduzione

Il progetto che proponiamo in questo lavoro consiste in un fluorimetro basato su un fotomoltiplicatore a stato solido (SiPM). La luce prodotta dal fenomeno della fluorescenza in genere è piuttosto debole ed è comunque sempre collegata alla concentrazione della molecola che emette la luce di fluorescenza (fluoroforo). La misura quantitativa della fluorescenza può quindi essere un modo per determinare la concentrazione del fluoroforo.

Dato che il SiPM funziona bene in regime pulsato, la luce di eccitazione della fluorescenza viene prodotta da un led pilotato con un pulser (Fast LED Light Pulser & SiPM). In questo modo otteniamo impulsi di luce molto brevi. La figura sotto mostra il setup che consiste in una “dark box” contenente LED, SiPM e cuvette contenente la soluzione con il fluoroforo. Nella dark box è stata anche collocata l’elettronica di front-end. Il resto del set-up consiste nel pulser che genera l’impulso di corrente inviato al LED e lo shaping amplifier per l’amplificazione dell’impulso da inviare al multichannel analyzer.

Come mostrato nell’immagine sotto, l’elettronica di front-end prevede l’utilizzo alternativo di un charge amplifier, per misure di energia/ampiezza del segnale, e di un trans-impedance amplifier, per misure di timing/coincidenza. In questa applicazione abbiamo utilizzato principalmente il charge amplifier.

Le immagini sotto mostrano il dettaglio del cuvette holder e dei supporti per il LED e per il SiPM. Il LED è provvisto di un filtro di eccitazione, mentre il SiPM è provvisto di un filtro di emissione. Il filtro di eccitazione seleziona la lunghezza d’onda (nel range del blu) necessaria per eccitare i fluorocromi. Il filtro di emissione, invece, trasmette solo la luce emessa dal campione (nel range del verde) bloccando la luce di eccitazione parassita.

L’immagine sotto mostra le provette contenenti una soluzione di fluoresceina a diverse concentrazioni.

Il segnale amplificato viene poi acquisito dalla scheda Red Pitaya ed elaborato con l’applicazione multichannel analyzer (Spettroscopia Alfa con Red Pitaya). Il risultato è mostrato nel grafico seguente. In esso sono sovrapposti, sullo stesso grafico, gli “spettri” di segnale corrispondenti a diverse (crescenti) concentrazioni di fluoresceina.Per ognuna delle misure abbiamo fatto un fit gaussiano, determinando così l’intensità del segnale, corrispondente al canale di picco. L’intensità del segnale è stata messa in relazione alla concentrazione di fluoresceina, predeterminata durante la preparazione della soluzione.

Il risultato è una relazione lineare, come mostrato nel grafico successivo.

Conclusioni

Il fluorimetro che abbiamo descritto in questo articolo si è dimostrato uno strumento efficiente ed adatto soprattutto alla misurazione di piccole concentrazioni di fluoroforo. L’aspetto più critico è il LED-pulser perché la linearità della misurazione si basa sulla costanza e sulla ripetitività degli impulsi luminosi prodotti dal LED. Un certo grado di spreading delle intensità degli impulsi è inevitabile. A questo si può in parte ovviare facendo un elevato numero di misure ed applicando ai dati un fitting gaussiano in modo da individuare il valore medio statistico.

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