Misure di Turbidimetria e Nefelometria

Abstract: in questo post descriviamo l’applicazione dello spettrometro SMA Thunder Optics e del software Spectragryph nelle misure di turbidimetria e nefelometria.

Introduzione

In un post precedente: Spettrometro Thunder Optics & Spectragryph, abbiamo descritto lo spettrometro SMA della Thunder Optics (nel seguito indicato come spettrometro TO) e lo abbiamo utilizzato per acquisire gli spettri di alcune sorgenti luminose. Proseguiamo ora l’attività di sperimentazione utilizzando questo strumento per misure di turbidimetria e nefelometria.

Misure di Torbidità

La torbidità è una proprietà ottica dovuta alla presenza nel liquido di particelle in sospensione come argilla, sostanze colloidali, e microorganismi che causano la dispersione e l’assorbimento della luce. La misura dell’assorbimento e della dispersione della luce può essere convenientemente utilizzata, dopo adeguata calibrazione, al fine di determinare la concentrazione delle particelle in sospensione. I fenomeni ottici provocati dalle particelle in sospensione dipendono fortemente dalle dimensioni delle particelle e dalle proprietà ottiche delle stesse. Le misure di torbidità si dividono in due grandi categorie: turbidimetria e nefelometria. La turbidimetria, che consiste nella misura dell’assorbimento della luce, viene applicata quando la dimensione delle particelle che provocano torbidità è dell’ordine o superiore al micrometro: in questa condizione l’assorbimento prevale sulla diffusione. Nel caso in cui le particelle abbiano dimensioni più piccole, dell’ordine di decine o centinaia di nanometri, prevale l’effetto diffusivo e viene pertanto utilizzata una metodica differente, chiamata nefelometria che consiste nella misura della luce diffusa.

La turbidimetria si basa sulla classica misura dell’assorbanza della sospensione, mentre nella nefelometria si misura la luce diffusa ponendo il sensore ad angolo retto rispetto alla direzione di arrivo della luce. Il sensore può essere ad esempio un fotodiodo oppure può essere utilizzato anche un sensibile spettrofotometro.

La calibrazione del turbidimetro viene ottenuta mediante la misura di sospensioni standard di formazina. Si tratta di soluzioni campione che forniscono un riferimento calibrato in unità di misura standard. Queste soluzioni campione sono però piuttosto costose, nel nostro laboratorio amatoriale abbiamo utilizzato un approccio diverso: abbiamo preparato una serie di sospensioni miscelando acqua distillata con olio da taglio emulsionabile, facilmente reperibile anche online. Aumentando la percentuale di olio si ottengono sospensioni con torbidità via via crescente. In questo modo non possiamo fare misure “assolute”, confrontabili con le misure ottenute con turbidimetri professionali, possiamo però valutare la linearità delle misurazioni ed avere un termine di confronto. Le nostre sospensioni campione (Fig. 1) sono state ottenute miscelando olio ed acqua nelle concentrazioni di 5 ml/l, 10 ml/l, 25 ml/l e 50 ml/l.

Fig. 1 – Sospensioni di riferimento per la torbidità

Turbidimetria

Per le misure di turbidimetria abbiamo utilizzato lo spettrometro TO insieme alla cella porta-cuvette (cuvette holder) ed alla sorgente ad incandescenza Mini Light Source sempre della Thunder Optics, il tutto nella configurazione adottata per la misura della assorbanza, come descritto nel post Spettroscopia di Assorbimento e raffigurato in Fig. 2.

Fig. 2 – Setup sperimentale per la misura della torbidità

Le misure di assorbanza sono raffigurate in Fig. 3, dove vengono riportati gli spettri di assorbimento per le varie sospensioni di riferimento. Come atteso, si vede come l’assorbanza aumenti all’aumentare della concentrazione della sospensione, in particolare per lunghezze d’onda del vicino ultravioletto. Abbiamo scelto la lunghezza d’onda di circa 380 nm per rilevare i valori di assorbanza e metterli in relazione alla concentrazione della sospensione, in modo da verificare la linearità della relazione e disegnare la curva di calibrazione (Fig. 4).

Fig. 3 – Spettri di assorbimento delle sospensioni di riferimento

Fig. 4 – Curva di calibrazione assorbanza-concentrazione

Nefelometria

Per le misure di nefelometria abbiamo utilizzato lo spettrometro TO insieme alla cella porta-cuvette (cuvette holder) ed alla sorgente laser DPSS emittente a 635 nm, il tutto nella configurazione raffigurata in Fig. 5. Si può notare come la sorgente di luce e la fibra per la raccolta della luce diffusa siano disposte ad angolo retto.

Fig. 5 – Setup sperimentale per la misura di nefelometria

I risultati delle misure sono mostrati in Fig. 6, dove vengono riportati gli spettri della luce diffusa dalle nostre sospensioni di riferimento. La sorgente di illuminazione è un laser DPSS che emette sul rosso a 635 nm, la luce diffusa avrà la medesima lunghezza d’onda ed intensità crescente all’aumentare della concentrazione della sospensione. Abbiamo misurato l’intensità di picco per ogni spettro e la abbiamo messa in relazione alla concentrazione della sospensione, in modo da verificare la linearità della relazione e disegnare la curva di calibrazione (Fig. 7).

Fig. 6 – Spettri della luce diffusa dalle sospensioni di riferimento

Fig. 7 – Curva di calibrazione scattering-concentrazione

Applicazioni della Turbidimetria per il Monitoraggio della crescita Batterica

Le tecniche fotometriche per la misura della torbidità possono essere utilizzate per valutare quantitativamente la popolazione batterica all’interno di una soluzione liquida. Batteri, funghi ed altri organismi unicellulari, se presenti in concentrazione sufficiente, rendono il liquido torbido, misurando la torbidità è possibile quindi risalire alla quantità di microorganismi presenti. In questo modo si può, ad esempio, monitorare il tasso di crescita batterica in funzione della temperatura o della concentrazione di nutrienti presenti nella soluzione.

Incubatore

Per la crescita batterica e di lieviti è stato predisposto un semplice incubatore che ha la funzione di mantenere la sospensione con il brodo di coltura ed i microorganismi alla temperatura ideale per la crescita. Si tratta di un contenitore termo-isolato in polistirolo al cui interno è posta la fonte di calore, cioè una semplice lampadina da 25 W, pilotata da un circuito di termoregolazione che permette di configurare la temperatura richiesta (range: 25 °C – 40 °C). L’incubatore è mostrato in Fig. 8.

Fig. 8 – Incubatore per la crescita di lieviti e batteri a temperatura controllata

Brodo di Coltura

Abbiamo preparato un brodo di coltura per la crescita di lieviti. I lieviti sono un gruppo di funghi, formati da un unico tipo di cellula eucariotica, che possono avere forma ellittica o sferica. Il lievito più comunemente usato è un saccaromicete, termine scientifico Saccharomyces cerevisiae, che è “addomesticato” da migliaia di anni per la produzione di vino, pane e birra.

La soluzione è stata ottenuta sciogliendo 10 g di glucosio e 10 g di peptone di soia in 500 ml di acqua deionizzata. Il peptone è un prodotto intermedio della scissione enzimatica delle proteine. Il glucosio ed il peptone servono ad attivare i lieviti in modo che abbia inizio il processo di fermentazione e di riproduzione delle cellule. In Fig. 9 mostriamo il brodo di coltura e la beuta con il lievito in fermentazione.

Fig. 9 – Brodo di Coltura e Fermentazione del Lievito

Fermentazione e Crescita del Lievito

Al brodo di coltura abbiamo addizionato un granello di lievito di birra fresco ed abbiamo posto la soluzione liquida all’interno dell’incubatore configurato per mantenere una temperatura di 36 °C. Ad intervalli regolari, ad esempio ogni 30 min, si preleva una piccola quantità della soluzione e la si immette in una cuvette per la misura della torbidità. Per la misura della torbidità si può utilizzare sia il metodo della misura  di assorbanza che il metodo nefelometrico. Noi abbiamo adottato il metodo nefelometrico che prevede la misura della luce diffusa dal campione. La misura è riportata in Fig. 10 : nella prima fase non c’è crescita e la torbidità della soluzione è bassa, poi inizia la crescita dei lieviti, la soluzione diventa più torbida ed aumenta via via la luce diffusa. Nell’ultima fase la situazione diventa stazionaria e la torbidità rimane pressochè costante. Mettendo in grafico la densità ottica della sospensione in funzione del tempo si ottiene la curva di crescita mostrata nella immagine a lato.

Fig. 10 – Spettri della luce diffusa dalla sospensione con il lievito

Conclusioni

Il nostro apparato composto dallo spettrometro SMA Thunder Optics corredato dai vari accessori si è dimostrato adatto per misure di turbidimetria e nefelometria. Questo ci ha permesso di applicare con successo le tecniche spettrofotometriche alla misura di torbidità di soluzioni colloidali. Come esempio significativo, abbiamo applicato questa tecnica per il monitoraggio della crescita del lievito in un brodo liquido di coltura.

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