Spettroscopia dei Pigmenti della Fotosintesi

Abstract: in questo post descriviamo l’applicazione dello spettrometro SMA Thunder Optics e del software Spectragryph alla analisi spettroscopica dei pigmenti responsabili del processo fotosintetico, pigmenti che si trovano in tutti gli organismi vegetali (piante e alghe). 

Introduzione

In un post precedente: Spettrometro Thunder Optics & Spectragryph, abbiamo descritto lo spettrometro SMA della Thunder Optics (nel seguito indicato come spettrometro TO) e lo abbiamo utilizzato per acquisire gli spettri di alcune sorgenti luminose. Proseguiamo ora l’attività di sperimentazione utilizzando questo strumento per effettuare l’analisi spettroscopica delle molecole che si trovano nelle piante e nelle alghe e che sono responsabili del fondamentale processo della fotosintesi.

Tutti gli organismi fotosintetici, sia procariotici che eucariotici, catturano l’energia luminosa del sole attraverso l’impiego di pigmenti. Si tratta di composti strutturalmente e chimicamente differenti, ma che presentano quale fattore unificante la presenza di doppi legami coniugati. Ad eccezione dei batteri che effettuano una fotosintesi anossigenica, in tutte le altre specie il pigmento del centro di reazione è costituito da una clorofilla a. Ogni centro di reazione è corredato però da un gran numero di pigmenti accessori, che concorrono a raccogliere i fotoni e a convogliarli al sito attivo. Alcuni di essi, inoltre, sono in grado di dissipare un eventuale eccesso di radiazione, evitando che questo possa determinare un fotodanno. Tra questa nutrita serie di pigmenti ricordiamo le clorofille, i carotenoidi (suddivisi in xantofille e caroteni a seconda che abbiano o meno atomi di ossigeno nella loro struttura) e le ficobiline.

La capacità di ogni pigmento di raccogliere l’energia luminosa varia in funzione dell’energia del fotone. In altre parole, i diversi composti assorbono meglio la luce in punti differenti dello spettro luminoso. Misurando l’assorbanza di un campione che contenga il pigmento solubilizzato e separato dagli altri, è possibile costruire uno spettro di assorbimento, caratteristico di ognuna di queste sostanze, in cui possono essere presenti diversi massimi d’assorbimento. [tratto da “Esperienze di Laboratorio per la Didattica del Settore BIO/04” Società Italiana di Fisiologia Vegetale].

β-Carotene

Il Beta Carotene è una molecola che appartiene alla categoria dei carotenoidi. I carotenoidi sono pigmenti secondari o accessori che assorbono la luce e che si trovano nelle membrane tilacoidi all’interno dei cloroplasti, i quali a loro volta si trovano nelle cellule vegetali.  Questi pigmenti possono presentare colore giallo, rosso o viola. I carotenoidi di colore giallo sono la luteina, mentre il rosso-arancio caratterizza il β-carotene. I pigmenti carotenoidi assorbono la luce a lunghezze d’onda che non sono assorbite dalle clorofille, quindi sono recettori di luce supplementari. Esistono 2 tipi di carotenoidi; caroteni e xantofille. Il carotene è di colore arancione mentre le xantofille sono di colore giallo. Questi pigmenti accessori proteggono la clorofilla dalla fotoossidazione e trasferiscono l’energia luminosa alle clorofille. I carotenoidi si manifestano nelle foglie mature quando la clorofilla inizia a disintegrarsi.

Il campione di Beta Carotene che abbiamo analizzato è costituito da un estratto di carota solubilizzato in olio (Fig. 1)

In Fig. 2 mostriamo la formula di struttura delle due principali molecole carotenoidi: la Luteina ed il Beta Carotene.  Si tratta di molecole lineari con un alto livello di coniugazione (doppi legami alternati a legami singoli tra gli atomi di carbonio). In queste condizioni gli elettroni si trovano “dispersi” lungo tutta la molecola e possono essere modellati come una particella confinata in una scatola monodimensionale avente le dimensioni della molecola. Questi elettroni delocalizzati sono resposabili dello spettro di assorbimento del beta carotene (Fig. 3).

Fig. 2 – Formula di struttura dei carotenoidi

Lo spettro di assorbimento misurato con il nostro spettrometro TO è riportato nel grafico seguente. La banda di assorbimento si estende dai 350 nm ai 500 nm, con due massimi a circa 430 nm e 480 nm.

Fig. 3 – Spettro di Assorbimento del Beta Carotene

Clorofilla

Le piante fotosintetiche hanno un pigmento primario che assorbe la luce noto come clorofilla. La clorofilla è un composto porfirinico di magnesio insolubile in acqua. Può assorbire la luce a una lunghezza d’onda inferiore a 480 nm e con lunghezza d’onda compresa tra 550 e 700 nm. Quando la luce solare bianca incide su uno strato di clorofilla, la luce verde con una lunghezza d’onda compresa tra 480 e 550 nm non viene assorbita ma viene riflessa, motivo per cui le clorofille delle piante e le foglie intere sono verdi. La clorofilla è un pigmento verde con struttura policiclica e planare.

Esistono diverse classi di clorofille, le principali sono la clorofilla-a (chl-a) e la clorofilla-b (chl-b). Nelle piante, il rapporto tra chl-a e chl-b è di circa tre a uno. Solo chl-a è un costituente dei centri di reazione fotosintetici e quindi può essere considerato il pigmento centrale della fotosintesi. Inoltre, l’energia luminosa assorbita da chl-b può essere trasferita in modo molto efficiente a chl-a. In questo modo chl-b migliora l’efficienza del processo per l’utilizzo dell’energia solare. La struttura di base della clorofilla ha una “testa” con un anello di Mg-tetrapirrolo e una coda di fitolo. La testa della porfirina è costituita da 4 anelli pirrolici uniti da ponti CH. Il magnesio Mg++ è situato al centro dell’anello come atomo centrale. Mg++ è legato covalentemente a due atomi di N e legato in modo coordinato agli altri due atomi dell’anello tetrapirrolico (Fig. 4).

Fig. 4 – Formula di Struttura della Clorofilla [From “Science & Plants for Schools”]

Nella fotosintesi l’energia solare viene utilizzata dalle piante per ossidare l’acqua, con la conseguente liberazione dell’O2, e per ridurre la CO2 a zuccheri. La reazione generale della fotosintesi è la seguente:

La reazione indica quali sono i substrati e i prodotti della fotosintesi ma non fornisce informazioni sul meccanismo delle trasformazioni fotosintetiche. Il meccanismo della fotosintesi è un processo chimico molto complesso, in parte ancora non del tutto noto, fu per la prima volta proposto intorno al 1920 da Van Niel il quale concluse che la fotosintesi era sostanzialmente un processo redox.

Il campione che abbiamo analizzato è stato ottenuto sminuzzando foglie di spinaci e lasciandole macerare in alcol etilico. Il campione di clorofilla è mostrato in Fig. 4, insieme alla soluzione di ficocianina.

Fig. 5 – Soluzione di Ficocianina e soluzione di Clorofilla

La clorofilla presenta sia assorbimento che fluorescenza, per cui sono state fatte sia misure spettrometriche di assorbanza che di fluorescenza. In Fig. 6 riportiamo lo spettro di assorbimento della clorofilla (in verde) e della ficocianina (in blu). Si vede come la clorofilla abbia due bande di assorbimento, una posizionata nella banda del blu, da 350 nm a 500 nm ed una posizionata sul rosso centrata a circa 660 nm.

Lo spettro di fluorescenza è invece riportato in Fig.7, insieme ad una parte dello spettro di assorbimento. La curva di fluorescenza, che ha il massimo a 674 nm, segue l’andamento speculare dell’assorbimento, come accade solitamente (spostamento di Stokes).

Fig. 6 – Spettro di Assorbimento della Clorofilla e della Ficocianina

Fig. 7 – Spettro di Assorbimento e Fluorescenza della Clorofilla

Ficocianina

La ficocianina appartiene alla categorie delle ficobiline. Queste molecole sono tetra pirroli a catena aperta privi di Mg++ e della coda di fitolo. Le alghe verdi e le alghe rosse possiedono ficobiline come la ficoeritrina e la ficocianina. Anche questi sono pigmenti che raccolgono la luce e contribuiscono al processo della fotosintesi. Le ficobiline sono legate in modo covalente a specifiche proteine ​​leganti, formando ficobiliproteine, che si associano a formare complessi altamente ordinati chiamati ficobilisomi che costituiscono le strutture primarie di raccolta della luce nei microrganismi come le alghe verdi e le alghe rosse. In Fig. 8 riportiamo la formula di struttura delle ficobiline.

Fig. 8 – Formula di Struttura della Ficocianina e della Ficoeritrina

La ficocianina in polvere è facilmente reperibile sui mercati online oppure in negozi di prodotti naturali. Viene ottenuta come estratto da alghe verdi ed è solubile in acqua producendo soluzioni di un bel colore blu-azzurro. Il nostro campione è una soluzione acquosa di ficocianina, come mostrato nella Fig. 5. Come la clorofilla anche la ficocianina presenta fluorescenza con il massimo attorno a 640 nm. In Fig. 6 ed in Fig. 12 viene mostrato lo spettro di assorbimento, dove si nota che vi è assorbimento nella banda attorno alla lunghezza d’onda di 600 nm, mentre in Fig. 9 mostriamo lo spettro di fluorescenza e parte di quello di assorbimento, anche in questo caso lo spettro di fluorescenza e quello di assorbimento sono uno l’immagine speculare dell’altro.

Fig. 9 – Spettro di Assorbimento e Fluorescenza della Ficocianina

Ficoeritrina

La ficoeritrina è l’altra ficobilina presente nelle alghe rosse. Noi la abbiamo estratta a partire dall’alga palmaria palmata (nota anche come dulse) essicata. Abbiamo lasciato a macerare nell’acqua frammenti di alga essiccata, successivamente abbiamo congelato e scongelato questa poltiglia. L’operazione di congelamente ha l’effetto di rompere le pareti cellulari permettendo al pigmento di entrare in soluzione acquosa: la Fig. 10 mostra i frammenti di alga e la soluzione di ficoeritrina ottenuta dal procedimento di estrazione. Questo pigmento presenta fluorescenza arancione quando è eccitata da luce verde (Fig. 10).

Fig. 10 – Alga Palmaria Palmata e Fluorescenza della soluzione di Ficoeritrina

Con il nostro spettrometro abbiamo esaminato lo spettro di assorbimento e di fluorescenza della ficoeritrina. Gli spettri sono mostrati nella Fig. 11. Si vede come l’assorbimento presenti un massimo attorno a 550 nm, mentre la fluorescenza si colloca a circa 580 nm.

Fig. 11 – Spettro di Assorbimento e Fluorescenza della Ficoeritrina

Conclusioni

Se inseriamo nello stesso grafico gli spettri di assorbimento di tutti i pigmenti che abbiamo esaminato (Fig. 12) si evidenzia un fatto interessante: tutte le lunghezze d’onda che vanno dal vicino ultravioletto fino al limite dell’infrarosso sono assorbite da qualcuno dei pigmenti.

Fig. 12 – Spettri di assorbimento dei pigmenti coinvolti nel processo della Fotosintesi

Sappiamo che l’unica molecola fotoattiva è la clorofilla-a, gli altri pigmenti hanno però la funzione fondamentale di raccogliere l’energia luminosa alla altre lunghezze d’onda e convogliarla verso la molecola della clorofilla-a.

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