Tecniche Spettrofotometriche

Abstract: in questo post descriviamo l’applicazione dello spettrometro SMA Thunder Optics e del software Spectragryph nelle misure di spettrofotometria. Applicheremo le tecniche spettrofotometriche per la misura della concentrazione di un soluto mediante la misura della assorbanza e della fluorescenza. Applicheremo inoltre la spettrofotometria allo studio della cinetica di una reazione chimica.

Introduzione

In un post precedente: Spettrometro Thunder Optics & Spectragryph, abbiamo descritto lo spettrometro SMA della Thunder Optics (nel seguito indicato come spettrometro TO) e lo abbiamo utilizzato per acquisire gli spettri di alcune sorgenti luminose. Proseguiamo ora l’attività di sperimentazione “esplorando” con questo strumento, con i suoi accessori e con il software spectragryph, le tecniche spettrofotometriche di misura di assorbanza e di fluorescenza per la determinazione della concentrazione di una sostanza in una soluzione liquida. Utilizzeremo inoltre la spettrofotometria di assorbanza per lo studio della cinetica di uan reazione chimica.

Determinazione della concentrazione di una soluzione di Permanganato di Potassio (KMnO₄)

In ottica la legge di Lambert-Beer, è una relazione empirica che correla la quantità di luce assorbita da un mezzo, alla natura chimica, alla concentrazione ed allo spessore del mezzo attraversato. Quando un fascio di luce (monocromatica) di intensità I₀ attraversa uno strato di spessore l di un mezzo, una parte di esso viene assorbita dal mezzo stesso e una parte ne viene trasmessa con intensità residua I. Viene definita la trasmittanza (T) il rapporto I/I₀ e come assorbanza (A) l’opposto del logaritmo della trasmittanza A = log(1/T).
Il rapporto tra le intensità della luce trasmessa e incidente sul mezzo attraversato è espresso dalla seguente relazione :

dove k_λ è il coefficiente di attenuazione (che è una costante tipica del mezzo attraversato e dipende dalla lunghezza d’onda λ) ed l è lo spessore di soluzione attraversata. La legge si può esprimere anche con la relazione:

A = k_λ l

che per una soluzione viene ulteriormente modificata in:

A = ε_λ l M

dove ε_λ è detto coefficiente di assorbimento molare, M è la molarità della soluzione e l è il cammino geometrico. Il valore di ε_λ è considerato costante per una data sostanza ad una data lunghezza d’onda, benché possa subire lievi variazioni con la temperatura. Inoltre, la sua costanza è garantita solo all’interno di un dato intervallo di concentrazioni, al di sopra delle quali la linearità tra assorbanza e concentrazione non è più rispettata a causa di una serie di fenomeni chimico-fisici.
Con il nostro spettrofotometro ad assorbimento abbiamo verificato la legge di Lambert-Beer utilizzando soluzioni diluite di permanganato di potassio. Come noto questo composto è solubile in acqua e le soluzioni hanno un caratteristico colore che, a seconda, della concentrazione, va dal rosa al viola scuro.
Per la misura dell’assorbanza delle soluzioni si può utilizzare lo spettrometro TO accoppiato con il cuvette holder e con la sorgente di luce di riferimento (Fig. 1 a). Le soluzioni da esaminare sono state inserite nelle classiche cuvette da spettrofotometria (12x12x45 mm), di materiale plastico “usa e getta” (Fig. 1 b).

Fig. 1 – (a) Setup per le misure di assorbanza , (b) Cuvette con la soluzione di KMnO₄

Le soluzioni “campione” hanno concentrazione nota: 8×10^-4 M, 4×10^-4 M, 2×10^-4 M, 1×10^-4 M. Le soluzioni sono state ottenuto pesando 0,0125 g di composto (la massa molare del permanganato è di 158 g/mol) e sciogliendolo in 100 ml di acqua distillata; così si ottiene una soluzione con concentrazione 8×10^-4 M. Per diluizioni successive si ottengono le altre concentrazioni. Gli spettri di assorbanza sono mostrati in Fig. 2.

Fig. 2 – Spettri di assorbanza delle soluzioni a concentrazione nota di KMnO₄

Dagli spettri abbiamo ricavato il valore della massima assorbanza alla lunghezza d’onda di circa 525 nm per ognuna delle soluzioni. Riportando in grafico (Fig. 3) il valore della assorbanza in funzione della concentrazione (molarità) della soluzione otteniamo il legame lineare tra assorbanza e molarità espresso dalla legge di Lambert-Beer: A = ε_λ l M.

Fig. 3 – Retta di calibrazione per l’assorbanza delle soluzioni di KMnO₄

Fig. 4 – Spettro di assorbanza della soluzione di KMnO₄ a concentrazione incognita

Conoscendo la retta di calibrazione del nostro spettrofotometro per l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 525 nm della soluzione di permanganato di potassio è possibile utilizzare la misura spettrofotometrica per la determinazione della concentrazione di una soluzione di molarità non conosciuta. La Fig. 4 riporta la misura della soluzione “incognita” che fornisce per l’assorbanza un valore pari a 0,76. Inserendo questo valore nella equazione della retta di regressione otteniamo che la concentrazione della soluzione è di 0,45×10^-3 M.

Determinazione del contenuto di Riboflavina (vitamina B2) in un complesso multivitaminico

La riboflavina, anche nota come vitamina B2, è una vitamina idrosolubile del gruppo B. E’ un componente fondamentale di diversi coenzimi ed è necessaria per la respirazione cellulare. La riboflavina è anche un composto fluorescente. In questo esperimento, utilizziamo le proprietà di fluorescenza della riboflavina per determinare la quantità di questo composto contenuta in un integratore alimentare multivitaminico.
Come per le misurazioni dell’assorbanza,  può essere utilizzata la legge di Beer per le misurazioni della fluorescenza. l’intensità della luce emessa, I, è direttamente proporzionale alla concentrazione, c, del composto chimico emittente presente nel campione:

I = k I₀ c

L’intensità della luce emessa dipende dall’intensità della luce fornita per l’eccitazione, I₀, e dalla concentrazione, c, del campione. Il termine k di proporzionalità include sia il coefficiente di estinzione (o coefficiente di assorbimento molare) alla lunghezza d’onda di eccitazione che la lunghezza del percorso del raggio di luce che attraversa campione.

In Fig. 1 a e Fig. 1 b, viene mostrato il setup sperimentale composto da spettrometro, cuvette holder e fibra ottica a Y. La sorgente di eccitazione è un laser DPSS che emette a 445 nm (emissione sul blu). L’emissione di fluorescenza viene raccolta ad angolo retto dai due collimatori collegati alla fibra ottica a Y.

Fig. 5 – (a) Setup per le misure di fluorescenza , (b) Cuvette con la soluzione di riboflavina

Come per la spettroscopia di assorbanza, è necessario calibrare in via preliminare lo spettrometro a fluorescenza utilizzando un set di soluzioni standard a concentrazione nota. Misurando la fluorescenza di un insieme di soluzioni standard di concentrazione nota, è possibile creare una curva di calibrazione che mostri come lo strumento risponde ai cambiamenti di concentrazione. È poi possibile confrontare la risposta dello spettrometro alle soluzioni a concentrazione nota con la risposta dello spettrometro ad una soluzione a concentrazione sconosciuta; in questo modo la legge di Beer ci consente di determinare la concentrazione della soluzione sconosciuta. In Fig. 6 a vengono mostrate le soluzioni campione di riboflavina a concentrazione nota ed in Fig. 6 b l’integratore alimentare di cui vogliamo determinare il contenuto in vitamina B2.

Fig. 6 – (a) Soluzioni di riboflavina , (b) Complesso multivitaminico

In Fig. 7 vengono mostrati gli spettri di assorbanza e di fluorescenza della riboflavina, acquisiti con lo spettrometro TO. Si vede che l’assorbanza ha un massimo alla lunghezza d’onda di circa 440 nm, questo giustifica l’utilizzo di un laser DPSS blu come sorgente di eccitazione. La banda di fluorescenza si colloca tra i 500 nm ed i 600 nm con il massimo a circa 520 nm.

Fig. 7 – Spettro di assorbanza della riboflavina (linea arancione) e spettro di fluorescenza (linea celeste)

Le soluzioni standard sono state ottenute sciogliendo 100 mg di riboflavina ad alta purezza in 1 l di acqua distillata. Conoscendo la massa molare della molecola (376,3639 g/mol) si calcola che la soluzione che si ottiene ha concentrazione pari a 53×10^-6 M. Diluendo ulteriormente la soluzione iniziale si ottengono le soluzioni alle concentrazioni di 26, 17, 12,7 e 10,2 μM che abbiamo utilizzato come soluzioni standard di calibrazione.

Fig. 8 – Spettri di fluorescenza delle soluzioni a concentrazione nota di riboflavina

Dagli spettri di fluorescenza abbiamo ricavato il valore della massima intensità alla lunghezza d’onda di circa 520 nm per ognuna delle soluzioni. Riportando in grafico (Fig. 9) il valore della intensità della fluorescenza in funzione della concentrazione (molarità) della soluzione otteniamo il legame lineare tra fluorescenza e molarità espresso dalla legge di Beer: I = k I₀ c.

Fig. 9 – Retta di calibrazione per la fluorescenza delle soluzioni di riboflavina

Fig. 10 – Spettro di fluorescenza della soluzioni del complesso multivitaminico

Conoscendo la retta di calibrazione del nostro spettrofotometro per la fluorescenza della soluzione di riboflavina alla lunghezza d’onda di 520 nm è possibile utilizzare la misura spettrofotometrica per la determinazione della concentrazione di una soluzione di molarità non conosciuta. La Fig. 10 riporta la misura della soluzione “incognita” che fornisce per l’intensità di fluorescenza un valore pari a 10,7. Inserendo questo valore nella equazione della retta di regressione otteniamo che la concentrazione della soluzione è di 8,2×10^-6 M. Sapendo che la soluzione è stata ottenuta sciogliendo il contenuto di una capsula in 250 ml di acqua possiamo ricavare facilmente la quantità di riboflavina che risulta di 0,77 mg.

Studio della Cinetica della reazione chimica tra il colorante “Crystal Violet” e l’Idrossido di Sodio

Il crystal violet è un colorante comunemente usato come colorante biologico. In soluzione acquosa è di un colore viola intenso. In presenza di una base forte (ad esempio l’idrossido di sodio NaOH), il colore della soluzione sfuma dal viola all’incolore. La cinetica del processo chimico di cambiamento del colore può essere analizzata utilizzando la spettrofotometria di assorbanza in cui l’intensità del colore della soluzione viene registrata rispetto al tempo per determinare la legge di velocità.
Nella Fig. 11 mostriamo la soluzione di crystal violet e la soluzione di NaOH.

Fig. 11 – A sinistra soluzione di crystal violet, a destra soluzione di idrossido di sodio

La reazione del crystal violet con l’idrossido di sodio produce una molecola che è incolore, la reazione può essere rappresentata nello schema seguente:

Fig. 12 – Reazione del Crystal Violet con NaOH

All’istante T₀ il prodotto della reazione (CVOH) è assente mentre la concentrazione del colorante (CV) è massima. Con il procedere della reazione la concentrazione del colorante diminuisce mentre la concentrazione di CVOH, che è incolore, aumenta: il risultato è che la soluzione diventa progressivamente incolore. La concentrazione del colorante CV può essere misurata mediante la tecnica della spettrometria di assorbanza, in questo modo possiamo monitorare la cinetica della reazione e misurare la sua velocità. La misura è mostrata nel grafico di Fig. 13.

Fig. 13 – Spettri di assorbanza della soluzione acquisiti ad intervalli di 10 sec.

I valori di assorbanza sono stati misurati alla lunghezza d’onda di 590 nm e sono stati riportati in funzione del tempo nel grafico in scala semi-logaritmica di Fig. 13. L’andamento decrescente della assorbanza è ottimamente approssimato da una legge esponenziale con costante di tempo di 167 secondi.

Fig. 14 – Valori di assorbanza a 590 nm in scala semi-logaritmica approssimati da legge esponenziale

Dai risultati ottenuti e descritti sopra possiamo ricavare informazioni sulla cinetica della reazione. In generale la legge sulla velocità della reazione è la seguente:

Rate = k [CV+]^m[OH-]ⁿ (1)

Dove k è una costante di proporzionalità, mentre m ed n sono gli ordine di reazioni dei singoli reagenti. I valori dei singoli ordini di reazione m e n vanno determinati sperimentalmente.
Una reazione è solitamente di ordine zero, primo o secondo ordine. Una reazione di ordine zero è quella in cui la velocità è indipendente dalla concentrazione dei reagenti, risultando quindi costante con valore k. Una reazione del primo ordine è quella in cui la velocità dipende solo dalla concentrazione di un reagente e in cui m = 1. In questo caso la velocità diminuisce man mano che la reazione procede e la concentrazione del reagente [CV+] diminuisce. Una reazione del secondo ordine può essere quella in cui la velocità di reazione dipende dalla concentrazione di due diversi reagenti (ad esempio m = 1 e n =1), o dove la velocità di reazione dipende dalla concentrazione di un solo reagente (dove m = 2) . Per una reazione di secondo ordine, la velocità è proporzionale a [CV+]² e la diminuzione della velocità con il procedere della reazione è più rapida che per la reazione di primo ordine.

In questo esperimento, CV+ reagisce con concentrazioni di OH- di ordini di grandezza maggiori. Poiché l’idrossido di sodio ha concentrazioni molto maggiori, è ragionevole presumere che man mano che [CV+] diminuisce nel tempo, [OH-] rimane invece costante durante la reazione. Questo crea una condizione speciale che riduce l’equazione della velocità alla seguente relazione:

Rate = k’[CV+]^m (2)

Dove

k’ = k[OH-]ⁿ (3)

Possiamo anche scrivere:

Rate = Δ[CV+] / Δt = k’[CV+]^m (4)

La concentrazione [CV+] la misuriamo con la spettrofotometria di assorbanza e quindi possiamo ricavare il suo andamento nel tempo. Dai dato ottenuti è evidente che la concentrazione [CV+] diminuisce nel tempo con legge esponenziale. Sapendo che la soluzione della equazione (4) è una funzione esponenziale possiamo ricavare che m = 1, la nostra è quindi una reazione di ordine 1.

Conclusioni

Il nostro apparato composto da spettrometro SMA Thunder Optics e mini light source si è dimostrato più che adeguato per l’analisi spettrofotometrica di assorbanza e di fluorescenza. Questo ci ha permesso di applicare le tecniche spettrofotometriche alla determinazione del quantitativo di soluto presente in una soluzione a concentrazione incognita. La spettrometria di assorbanza ci ha inoltre permesso di studiare nel dettaglio la cinetica di una reazione chimica che, coinvolgendo una molecola colorante, può essere monitorata mediante lo spettrometro.

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