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Cos’è la Fluorescenza ?

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La fluorescenza è la proprietà di alcune sostanze di riemettere (nella maggior parte dei casi a lunghezza d’onda maggiore e quindi a energia minore) le radiazioni elettromagnetiche ricevute, in particolare di assorbire radiazioni nell’ultravioletto e riemetterla nel visibile.

Un esempio di questo processo lo vediamo in tutti i materiali che contengono pigmenti fluorescenti, come ad esempio nell’inchiostro degli evidenziatori e vernici fluorescenti.

Le proprietà fluorescenti di un oggetto spesso diventano evidenti con l’utilizzo di una lampada di Wood che mette radiazione nella banda degli ultravioletti, ma a seconda dei materiali può essere necessaria una lunghezza d’onda inferiore.

Il meccanismo della fluorescenza è il seguente : una radiazione incidente (nell’esempio della lampada di Wood si tratta di raggi ultravioletti) eccita gli atomi della sostanza fluorescente, promuovendo un elettrone a un livello energetico (orbitale) meno legato, più energetico e quindi più “esterno”. Entro poche decine di nanosecondi, l’elettrone eccitato torna al livello precedente in due o più fasi, passando cioè per uno o più stati eccitati a energia intermedia.

livelli Fluorescenza

Tutti i decadimenti tranne uno sono, di solito, non radiativi, mentre l’ultimo emette luce a lunghezza d’onda maggiore rispetto alla radiazione incidente (non necessariamente nello spettro visibile): questa luce è detta “fluorescenza”.

Possiamo quindi aspettarci che lo spettro di emissione si sovrapponga parzialmente allo spettro di assorbimento in corrispondenza della lunghezza d’onda corrispondente alla transizione di fluorescenza, mentre il resto dello spettro di emissione sia ad energia inferiore, o lunghezza d’onda maggiore.
In pratica, le transizioni interessate negli spettri di assorbimento ed emissione di rado coincidono esattamente, la differenza rappresenta una piccola perdita di energia per interazione della molecola assorbente con le circostanti molecole di solvente. Questa differenza viene chiamata “stokes shift”.

λem > λλa e λem sono i picchi degli spettri di assorbimento ed emissione.

Esempio di “Stokes Shift”

Spettri di assorbimento ed emissione di Arancio di Acridina. Si nota che la differenza tra i massimi è piuttosto contenuta : stokes shift = 537 – 525 = 12nm

L’assorbimento di energia per produrre il primo stato eccitato perturba poco la forma della molecola e questo significa che la distribuzione dei livelli vibrazionali dei primi stati eccitati è molto simile a quella dello stato fondamentale. Le differenze di energia tra le bande dello spettro di emissione saranno simili a quelle nello spettro di assorbimento e spesso lo spettro di emissione sarà approssimativamente una immagine speculare dello spettro di assorbimento.

Esempio di spettri speculari

Spettri di assorbimento ed emissione della ematoporfirina. Il primo picco di assorbimento e quello di emissione coincidono quasi perfettamente tra loro. La forma dei due spettri inoltre segue fedelmente la regola della immagine speculare.

Poiché l’emissione della fluorescenza avviene sempre dal livello vibrazionale più basso del primo stato eccitato, la forma dello spettro di emissione è praticamente sempre la stessa, anche cambiando la lunghezza d’onda della radiazione di eccitazione. Questa è nota come la legge di Kasha.

Esempio di spettri di emissione eccitati da differenti lunghezze d’onda

Spettri di emissione della fluoresceina. I massimi e la forma degli spettri coincidono nonostante le due differenti lunghezze d’onda di eccitazione. Nel secondo spettro sono visibili sia l’emissione anti-stokes (shift negativo) che l’emissione stokes (shift positivo).

La fluorescenza è soprattutto influenzata dalla struttura della molecola. Per esempio le molecole rigide che presentano doppi legami coniugati, ben si adattano alla fluorescenza : in particolare le molecole dove ci sono strutture aromatiche, in cui il fenomeno della risonanza dei doppi legami è distribuito lungo tutta la struttura, quando eccitate danno luogo ad  transizioni a π → π *, e quindi facilitano la fluorescenza.

Lo Spettrometro per lo studio della Fluorescenza

Per lo studio della fluorescenza abbiamo utilizzato lo spettrometro a reticolo già descritto in uno dei post precedenti (Spettrometro a Reticolo con Webcam), completato da una cella porta-campioni e da una sorgente di eccitazione. Gli spettri sono poi stati acquisiti con il software Theremino Spectrometer.

Fluorimetro
Schema di principio dello Spettrometro a Fluorescenza

Sorgenti di Eccitazione

Spettri di Fluorescenza

Alcune fra le sostanze fluorescenti esaminate

Clorofilla

La clorofilla (di qualsiasi tipo) presenta colore verde-giallastro, come visibile da una semplice cromatografia su carta. Da un punto di vista fisico, questo vuol dire che la clorofilla assorbe tutto le lunghezze d’onda dello spettro visibile tranne quelle in prossimità dei 490-590 nm.
Nel periodo autunnale la concentrazione di clorofilla nel fogliame diminuisce, quindi questo assume una colorazione bruno-rossiccia, che è data dalla presenza dei carotenoidi.
La misurazione dello spettro di assorbimento (ovvero del colore) della clorofilla viene svolta con metodiche di spettrofotometria.
La misura dell’assorbanza della luce è complicata dal solvente utilizzato per estrarre la clorofilla dalla materia vegetale, il che influenza i risultati ottenuti.
I picchi di assorbimento della clorofilla A sono a 665nm e 465nm. La clorofilla A diviene fluorescente a 673 nm. Il fatto che le clorofille A e B abbiano degli spettri di assorbimento differenti si traduce in un migliore assorbimento della radiazione solare per la fotosintesi clorofilliana.

FluoClorofilla
Spettri di Fluorescenza della Clorofilla eccitata da UV laser (I), da laser verde a 532nm (II) e da laser rosso a 650nm (III)

Fluoresceina

La fluoresceina sodica (o sale sodico della fluoresceina o uranina) è un indicatore.
A temperatura ambiente si presenta come un solido rosso-bruno inodore, che emette una intensa fluorescenza nella gamma 520-530 nm (di colore giallo-verde, molto caratteristica) quando viene eccitata da raggi ultravioletti a 254 nm e nella gamma del blu (465-490 nm).
Trattandosi di un colorante attivo anche ad elevatissime diluizioni, viene utilizzato in speleologia per individuare rami di corsi d’acqua sotterranei che, scomparendo nel sottosuolo per ricomparire altrove, diventerebbero problematici da seguire. Per questo tipo di applicazione, una certa quantità di fluoresceina viene disciolta nel corso d’acqua che si addentra nel sottosuolo e, successivamente, si cercano corsi d’acqua che a loro volta sono stati colorati.

fluoresceina
Spettri di Fluorescenza della Fluoresceina Sodica eccitata da UV laser e da laser verde

Olio di Oliva

oliveOilFluoL’olio di oliva extra-vergine ha un alto contenuto di clorofilla che viene facilmente evidenziato nello spettro di fluorescenza.

OLIOBUONO_FLUO_UV
Spettro di Fluorescenza dell’olio di oliva con il picco dovuto alla Clorofilla A

Olio di Oliva sottoposta a Cottura

L’olio di oliva sottoposto a riscaldamento (ad esempio durante una frittura) viene degradato. Il degradamento chimico comporta la creazione dei perossidi e la distruzione della clorofilla e questo si evidenzia facilmente facendo la spettrometria di fluorescenza.

OLIO_OLIVA_HEATED_FLUO_UV
Spettro di Fluorescenza dell’olio d’oliva dopo degrado termico, presenza dei picchi dovuti ai perossidi

Riboflavina (Vitamina B2) e Piridossina (Vitamina B6)

La riboflavina è un composto eterociclico ottenuto da una molecola di flavina cui è legata una catena formata da ribitolo. È un composto di colore giallo poco solubile in acqua, stabile al calore e fluorescente qualora sottoposto a luce ultravioletta. La piridossina, il piridossale e la piridossamina (e i corrispondenti esteri fosfati tra cui il più noto è il piridossalfosfato) sono le forme con cui si presenta la vitamina B6.

Chinino

Il chinino, formula chimica C20H24N2O2, è un alcaloide naturale avente proprietà antimalariche e analgesiche. Da letteratura il picco di emissione da fluorescenza del solfato di chinino è di 450 nm.

CHININO_FLUO
Spettro di Fluorescenza del chinino eccitato da UV laser

Cumarina

La cumarina  è un composto aromatico. A temperatura ambiente si presenta in forma di cristalli incolori, dall’odore caratteristico. Isolata per la prima volta da Dipteryx odorata, il cui nome popolare era per l’appunto coumarin, la cumarina è presente in più di 27 famiglie di vegetali, ed è responsabile dell’odore dolce dell’erba appena tagliata.
È la capostipite di una classe di composti derivati – detti cumarine – che hanno in comune la struttura benzopiranica della cumarina.
Anche le idrossicumarine sono presenti in molte famiglie: umbelliferone, esculetina e scopoletina sono le più comuni in natura. Cumarine più complesse come le furanocumarine sono limitate a poche famiglie (Rutaceae e Apiaceae); tipico esempio gli psoraleni fototossici presenti nell’olio essenziale di Bergamotto (esempio il bergaptene).
La cumarina è usato anche come un mezzo di guadagno in alcuni laser a colorante e come sensibilizzante in tecnologie fotovoltaiche.
Assorbe a lunghezze d’onda inferiore a 400 nm e presenta forte fluorescenza a 460 nm.

ALLURE_FLUO_UV
Spettro di Fluorescenza di acqua di colonia eccitata da laser UV, picco dovuto al contenuto di cumarina

Biofluorescenza

La fluorescenza è un fenomeno che si manifesta anche in molti organismi viventi. Molti fra pesci, crostacei, alghe e meduse sintetizzano molecole otticamente attive che presentano fluorescenza. Uno degli esempi più famosi ed importanti è la medusa aequorea victoria che produce la proteina denominata gfp (green fluorescent protein) molto utilizzata in biologia molecolare.
Un altro esempio di biofluorescenza è quello degli scorpioni. Si tratta di una curiosa caratteristica di questi aracnidi notturni i quali, se esposti a luce ultravioletta, emettono un bagliore verde brillante.
Tecnicamente la fluorescenza degli scorpioni è data dallo strato di ialina presente nella cuticola dell’esoscheletro che contiene sostanze della famiglia delle cumarine, ma la sua funzione resta ancora un mistero, anche se sono state proposte molte ipotesi a riguardo.
Nelle immagini sotto si vede uno scorpione sotto la lampada di wood ed il relativo spettro di emissione eccitato da laser UV.

 

Documento pdf con la descrizione degli esperimenti di fluorescenza : Fluorescenza_ITA

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